016-m-icb
Apparato per cromatografia ad alta pressione
WATERS ASSOCIATES, Absorbance detector model 440, Waters 510 HPLC Pump, Solvent progammer model 660, UK6 Injector
1975
keywords: cromatografia, alta pressione, separazione
Principali ambiti d’impiego: Chimica analitica, Chimica organica, Chimica sostanze naturali, Biochimica
Breve descrizione:
HPLC: High Pressure Liquid Chromatography.
Rappresenta l’evoluzione strumentale della cromatografia in fase liquida su colonna classica.
Alla base di tutte le tecniche cromatografiche vi è il coefficiente di distribuzione o di ripartizione che descrive il modo in cui una sostanza (molecola o anche analita) si distribuisce tra due fasi immiscibili di cui una, detta stazionaria, è immobilizzata (e può essere rappresentata da un solido, un gel, un liquido o una miscela solido/liquido), una invece è detta mobile (può essere liquida o gassosa). La fase mobile, dopo l’applicazione del campione da trattare, fluisce sopra o attraverso la fase stazionaria.
Nel corso della cromatografia i singoli componenti il campione (gli analiti) si muovono continuamente tra le due fasi. Le caratteristiche dei singoli analiti regolano questo fenomeno creando un rallentamento caratteristico per ciascun analita col risultato finale di una fuoriuscita dalla colonna in tempi diversi: da qui la possibilità di recuperare in maniera più o meno separata i vari componenti una miscela.
Come per qualsiasi tipo di cromatografia un’apparato per HPLC si compone di
– una colonna (con la fase stazionaria opportuna)
– un sistema di iniezione del campione (posto a monte delle colonna)
– un sistema di pompe in grado di far fluire la fase mobile ed il campione attraverso la colonna e di controllarne il flusso
– un programmatore di gradiente (indispensabile per quelle cromatografie in cui è necessario convogliare in colonna due diversi solventi in proporzioni prefissate costanti o variabili in maniera controllata nel tempo)
– un rivelatore (a indice di rifrazione, ad assorbimento UV-visibile, a fluorescenza, a spettrometria NMR, a spettrometria di massa, ecc) ed un registratore dei dati
– un raccoglitore di frazioni (che consente di raccogliere il liquido che fluisce dalla colonna in frazioni di piccolo volume). Spesso non è presente e si procede ad una raccolta mauale.
Il potere di risoluzione di una colonna cromatografica aumenta con la lunghezza della colonna e con la superficie della fase stazionaria e quindi per cui più piccole sono le particelle di cui si compone la fase stazionaria migliore sarà la risoluzione. Minori sono le dimensioni delle particelle maggiore sarà la resistenza al flusso della fase mobile. Per ovviare a questo inconveniente sono state sviluppate fasi stazionarie in grado di sopportare elevate pressioni e con esse la MPLC el’HPLC.
Le colonne usate per HPLC sono in genere in acciaio e costruite in modo da sopportare pressioni elevate Esiste una vasta gamma di supporti e fasi stazionarie (per cromatografia di adsorbimento, di partizione, a scambio ionico, a setaccio molecolare, ecc).
Trova molteplici applicazioni analitiche (o anche preparative) grazie all’elevata risoluzione ed i tempi di analisi che sono molto brevi.
